(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111435557.4 (22)申请日 2021.11.29 (71)申请人 湖南亚大丰晖新材 料有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市中国 （湖南） 自 由贸易试验区长沙片区星沙产业基地 开元东路1306号开阳智能制造产业园 （一期） 4# 栋103室 (72)发明人 蒋明贵　刘彩云　屈飞　 (74)专利代理 机构 长沙大珂知识产权代理事务 所(普通合伙) 4323 6 代理人 伍志祥 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/64(2006.01)C12N 5/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种靶向人非小细胞肺癌细胞株中EML4- ALK融合基因变 体1的载体及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 具体涉及一种靶 向人非小细胞肺癌细胞株中EML4 ‑ALK融合基因 变体1的载体及应用。 所述载体为包括绿色荧光 基因EGFP、 嘌呤霉素抗性基因、 Cas9蛋白编码基 因和分别针对EML4及ALK的sgRNA靶点等功能元 件的慢病毒载体。 该载体能够特异性地影响 EML4‑ALK融合基因变体1的表达， 而不影响EML4 和ALK基因的正常表达， 可用于治疗临床中由 EML4‑ALK变体1引起的相关疾病。 权利要求书1页 说明书9页 序列表8页 附图5页 CN 114107384 A 2022.03.01 CN 114107384 A 1.一种靶向人非小细胞肺癌细胞株中EML4 ‑ALK融合基因变体1的载体， 其特征在于， 包 括以下功能元件： 绿色荧光基因GFP、 嘌呤霉素抗性基因、 Cas9蛋白编码基因、 针对EML4的 sgRNA靶点E ML4‑sgRNA、 针对ALK的sgRNA靶点ALK ‑sgRNA。 2.根据权利要求1所述的载体， 其特征在于， 所述载体以CMV ‑Puro突变版 ‑T2A‑EGFP‑ pLentiCRIS PRV2GFP为出发载体。 3.根据权利要求2所述的载体， 其特征在于， 所述嘌呤霉素抗性基因和所述绿色荧光蛋 白GFP通过T2A元件串联， 由CMV启动子启动表达； 所述Cas9蛋 白由EF1a启动子启动表达； 所 述sgRNA靶点均由U6启动， 互不干扰。 4.根据权利要求1或3所述的载体， 其特征在于， 所述EML4 ‑sgRNA的核苷酸序列如SEQ   ID NO.2所示； 所述ALK ‑sgRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 5.权利要求1 ‑4任一项所述载体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 挑选并筛 选EML4‑sgRNA靶位 点； S2： 挑选并筛 选ALK‑sgRNA靶位 点； S3： 构建同时含有E ML4‑sgRNA和ALK ‑sgRNA的载体。 6.表达权利要求1 ‑4任一项所述载体的细胞。 7.根据权利要求6所述的细胞， 其特 征在于， 所述细胞为人非小细胞肺癌细胞。 8.根据权利要求7所述的细胞， 其特征在于， 所述人非小细胞肺癌细胞具体为NCI ‑ H3122。 9.权利要求1‑4任一项所述载体， 或权利要求6 ‑8任一项所述细胞的应用， 其特征在于， 所述应用为在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 所述肿瘤疾病为肺癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107384 A 2一种靶向人非小细胞肺癌细胞株中EML4 ‑ALK融合基因变体1 的载体及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种靶向人非小细胞肺癌细胞株中EML4 ‑ALK 融合基因变 体1的载体及应用。 背景技术 [0002]肺癌是全球最常见的死亡原因之一， 其中非小细胞肺癌(NSCLC)是一个主要死亡 原因。 以往大多数患者被诊断为疾病晚期， 一般只能做保守治疗。 识别发病的分子机制并进 行有针对性的治疗 对于实现肺癌临床治疗的改善及预防是 大有裨益的。 [0003]2007年， 在日本非小细胞肺癌(NSCLC)临床研究中发现部分患者存在间变性淋巴 瘤激酶(ALK)与棘皮微管相关蛋白样蛋白4(EML4)的融合， 能表达一种非常规的转化融合激 酶， 可以作为此类NSCLC的候选治疗靶点和诊断分子标志物。 该研究表明， 在非小细胞肺癌 (NSCLC)细胞中， 染色体2p内的一个小反转导致EML4 ‑ALK融合基因变体1 的形成， 该融合基 因包括EML4和ALK的一部分。 另外， 在一项主要涉及东亚患者的临床研究中报道3％ ‑13％的 肺肿瘤存在EML4 ‑ALK融合， 相当于全世界每年诊断出接近7万多名此类患者。 进一步的研究 发现， EML4 ‑ALK基因融合在肺癌患者和肺癌细胞系中最常见， 有独特的病理特征。 另外也有 一些报告发现E ML4‑ALK在其他癌症中存在， 包括乳腺癌和结直肠癌。 [0004]染色体倒位并不总是发生在相同的位置， 所有这些都涉及ALK的细胞内酪氨酸激 酶结构域， 始于外显子20编码的部分。 然而， EML4被不同程度地截断， 并产生各种EML4 ‑ALK 变异。 目前至少有11种不同的变异已被报道， 最常见的变异体有E13 ‑A20(指EML4(E)中与 ALK(A)融合的外显子)和E6a/b ‑A20也分别 被称为变异体1和3a/b。 这两种是EML4 ‑ALK最常 见的变异， 分别在33％和29％的非小细胞肺癌患者中检测到。 NSCLC细胞系NCI ‑H3122和 DFCI032含有E13； A 20变异， 而NCI ‑H2228含有E6a/b。 [0005]目前针对EML4 ‑ALK的非小细胞肺癌， 主要使用常规的化疗等， 以及 针对ALK激 酶的 抑制剂疗法， 但是效果并不显著。 近年来， 基因靶向药物的使用被推荐为一线治疗， 是一种 基于癌细胞的特异性突变的基因层面的治疗。 CRISPR/Cas9系统是最近几年发展起来的进 行基因编辑的强大工具， 可以对大部分物种的基因组进行精确编辑。 当同时将含有Cas9蛋 白编码基因和sgRNA共转染某个细胞时， sgRNA可以靶向目标序列， Cas9蛋白则会使相应的 DNA双链发生断裂。 然而， 由于EML4 ‑ALK是因基因易位导致的基因融合， 常规针对EML4和ALK 的基因编辑方案在 靶向EML4 ‑ALK融合基因变体1的同时， 将影 响正常的EML4和ALK基因的表 达。 发明内容 [0006]为了解决上述现有技术中存在的技术问题， 本发明提供了一种靶向人非小细胞肺 癌细胞株NCI ‑H3122中EML4 ‑ALK融合基因变体1的载体， 能够特异性地影 响EML4‑ALK融合基 因变体1的表达， 而不影响E ML4和ALK基因的正常表达 。说　明　书 1/9 页 3 CN 114107384 A 3